張金堅：次世代基因定序是萬能的嗎？
本文摘自＜常春月刊＞486期
文／張金堅（乳癌防治基金會董事長）
今年（2023年）7月29日健保署宣布，將於明年（2024）第二季把次世代基因定序納入健保，到底次世代基因定序是什麼？大家都仍然不甚明瞭； 有次世代，那麼第一代是什麼？有沒有第三代？也是大家心中的謎團，次世代基因定序在醫療領域有什麼用處？大家也是似懂非懂，本文將就基因定序的涵義及其在醫療領域上扮演的角色，做一綜合性的探討與分析，並與讀者分享！
基因定序的緣起
美國華裔分子生物學家吳瑞（圖一），（1928年生於北京，1982年當選中研院院士，2003年當選美國國家科學院院士），與他的實驗室團隊在1970年於康乃爾大學發展出以互補序列引子（primer），搭配帶有放射標記之核苷酸（nucleotide）的DNA定序技術，並成功驗證這項技術可用於定序在任何DNA序列。
七年後，英國分子生物學家Fred Sanger（圖二）發展出更快速的定序方式，因此於1980年二度獲得諾貝爾化學獎（他亦於1958年獲得諾貝爾化學獎），在1980年代前後，Sanger定序變成主流趨勢， 其定序採用會終止互補序列合成過程的 核苷酸。
因此在定序過程會產生許多長度不一的DNA片段，若將這些特殊核苷酸加上分別對應的A、T、C、G核苷酸的螢光標記，則將所有定序過程中產生的DNA片段依長度進行排序，再用光感應技術偵測各片段末段所顯示的螢光，就能快速讀出整段DNA序列。
也因此，Applied Biosystems（ABI）公司於1987年推出了全世界第一台全自動定序儀，而美國國家衛生研究院（NIH）也隨即在1990年正式啟動人類基因體定序計劃（HGP），2003年人體基因體定序的確認序列被發現，前後共費時13年，但Sanger定序必竟還是耗時耗錢，因此才有次世代定序的崛起，所謂次世代定序英文叫Next Generation Sequencing，簡稱NGS。
什麼是次世代基因定序（NGS）？
次世代基因定序（NGS）技術，均採大量並聯作業，因此須將整段DNA序列或基因體碎裂為許多小片段，再將這些片段進行PCR放大，然後以Sanger定序或更新的技術進行定序，最後再用強大的電腦將各片段的定序結果依其重疊序列進行整合，組成完整的序列。
目前NGS常用的技術共有五種技術（包括SOLiD定序技術、454 pyro定序、Dye定序、Combinatorial probe anchor synthesis（cPAS）及Ion torrent semiconductor sequencing），因牽涉到較艱深學理，不擬在此贅述。隨著次世代基因定序技術的問世，大幅縮短了相關研究的解序時間，同時拓展了基因體研究的深度及廣度，目前已有儀器與試劑通過美國FDA驗證，已廣泛應用，主要以遺傳性疾病、生殖醫學及癌症醫學發展最為快速。
至於次世代基因定序的技術基本原理及操作流程，大約分為樣本庫製備（library preparation）、樣本庫擴增（library amplification）、定序反應（sequencing reaction）及數據分析（data analysis）等四步驟，分述如下：（如圖三）
❶樣本庫製備（library preparation）：
將待測之樣品經核酸萃取後，利用物理性的方法（如超音波震盪法）或酵素 裁切等方式，將基因序列進行核酸片斷化（fragmentation），再將其末端接上銜接子（adaptor），以作為樣本庫。
❷樣本庫擴增（library amplification）：
藉由基因片段上的銜接子會與微磁珠（micro-beads）或晶片上的互補序列相結合，而固定於固相介質上，進行乳化聚合酶鏈鎖反應（emulsion PCR）或橋式聚合酶鏈鎖反應（bridge PCR）。
❸定序反應（sequencing reaction）：
次世代定序法依不同的定序平台，而有不同的定序原理。如Roche 454 定序平台是透過焦磷酸定序法（pyrosequencing）來定序的，過程中依序置入帶有4個不同鹼基的去氧核苷酸，當核酸聚合酶將去氧核苷酸接合時，釋出焦磷酸根離子（pyrophosphate），釋出的焦磷酸根因 ATP 硫酸酶（ATP sulfurylase）轉換產生ATP，再藉由冷光酶（luciferase）接收 ATP能量將冷光素（luciferin）進行氧化，最後由感測器測得訊號，透過反覆的試劑置換與偵測，得到大量定序的結果。
❹數據分析（data analysis）：
將定序後的大量資訊與現有的資料庫進行比對（mapping）及計數（counting） 分析，設法還原原始待測基因片段序列。
次世代基因定序技術在臨床上的應用
誠如上述，次世代基因的技術可以廣泛應用遺傳性疾病、生殖醫學及癌症醫學方面（如表一），由於本人的專長投入在癌症治療領域，所以以下將會介紹次世代基因定序在癌症診療中扮演的角色為主，次世代基因在癌症治療的應用是做一個全面的腫瘤基因檢測， 找出可能與腫瘤相關的基因，其中有部分基因突變，是使腫瘤不受控制地擴展最主要的原因，稱之為主驅動基因。
一旦發現這類主驅動基因，我們可以相應地用一些針對性藥物作腫瘤治療。目前在治療肺癌上最主要應用次世代定序分析的情況是在擴散性非小細胞性肺癌上，尤其是當中最常見的一種稱為肺腺癌的肺癌。因為我們知道超過八成半以上的肺腺癌患者都有我先前提及過的主驅動基因，而其中超過六成以上有適合的標靶藥可以使用。這些標靶藥大部份都以口服形式服用，功效比傳統化療藥的藥效為高，同時副作用更少。（圖四）
國際上有四種基因突變，分別是EGFR、ALK、ROS-1以及BRAF，一般都會建議用標靶藥物作為一線治療。另外有超過五種以上主驅動基因有相關藥物可以使用，為晚期肺癌病人帶來一線生機，其他如乳癌、大腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌及 前列腺癌等，亦有次世代定序的檢測。
台灣每年約12萬人罹癌，許多病患在治療前會做次世代基因定序（NGS）看基因突變位點，以決定用何種標靶藥物，健保署在今年七月底表示，很多治療癌症的標靶藥物已經上市，這些藥物要針對特定的基因位點突變才會有效，但這些突變位點一定得做基因定序才能得知，因此要使用這些藥物前，就得先做檢驗，確定位點後搭配對應藥物，治療才有效。健保署預估的時程是在今年底前完成討論，明年搭配特管辦法上路，最快第二季或第三季 開始給付。
目前健保有給付15種癌症標靶藥物、對應8種癌症。肺癌、乳癌、大腸直腸癌和卵巢癌等癌症類別有較多的標靶藥物可使用。目前還未決定哪些癌症、哪段治療療程可適用基因定序給付，「給付要針對有效的藥，以及給付時機，看是終身一次給付，或是其它治療方式無效後才給付，這些牽涉給付人數多寡，會影響全額或部分給付，這些都環環相扣」。日本、南韓目前已經將次世代基因定序有條件納保，日本是鎖定常規治療無效的患者才給付次世代基因序列，韓國則是採取每人一次的定額給付。
次世代基因定序要花多少錢？
以台大醫院基因分子診斷實驗室公布的檢驗項目及費用表，癌症用的「癌症藥物基因檢驗」一次要價3萬8500元。健保署署長石崇良表示，這要看基因位點的多寡，如果要檢測的位點多，最高可能達十幾萬元，「給付多少位點？誰可以開檢驗單？哪些實驗室符合檢測資格？這些都是要討論的題目」。但隨著次世代基因定序的技術進步，其價格會慢慢降低，相信將來一定會被廣泛應用。
總之，新興標靶治療或免疫療法都必須透過生物標記（biomarker）的檢測來尋找治療的標的，生物標記多為基因突變而特殊表現在癌細胞，若一個一個突變基因檢測，恐無法因應臨床治療。次世代基因定序技術一次可以檢測多個基因，是提供醫師診療的有利工具，選對標靶藥物治療較有效。
然而次世代定序技術畢竟在臨床上仍是較新穎而且有許多未知因素的技術，在國外亦有其規範，像2020年及2023年相繼在歐洲腫瘤醫學會議，亦有相關規定，大致對一些癌症，像肺癌、乳癌、大腸直腸癌、前列腺癌，都有嚴格的規定，另外一些臨床試驗則有所謂伴隨式之次世代基因定序檢測，更重要的是，如果檢測出來的基因突變沒有對應標靶藥物可使用，就算是檢測出來，也無法改變現有的治療選擇，此乃目前較難突破的困境。
於2021年健保署已擬定次世代定序診斷納入健保給付之流程，分為提案、評估、討論及監測等四個階段，由醫療院所或學會提出申請，經健保署搜集資料評估，再交由專家諮詢會議及健保署共同擬定會議討論核定。
第三代基因定序（Non-PCR Swquencing）從研究走向應用
雖然次世代基因定序的數據輸出量與定序效能越來越強大，能在短時間內精確地分析大量的基因序列資訊，但因為其讀長較短（通常50-200bp），需要有參考序列或是繁雜的組裝演算（assembling algorithm）才能達到精準的結果。倘若遇到長片段的重複序列，或是全新物種的基因序列，就容易增加NGS定序錯誤的機率，因此第三代定序需求也就應運而生。
第三代定序技術又稱為單分子DNA定序，是通過現代光學、高分子、奈米技術等手段來區分鹼基信號差異的原理，以達到直接讀取序列信息的目的，所謂的第三代定序是指不需要透過PCR擴增放大的過程，直接對單一條長片段的DNA進行的基因定序，由於單一片段的DNA定序讀長較長，可以大幅減少序列組裝的複雜性，也較能夠判斷基因體中的高重複性序列的正確性，尤其在一些全新物種的基因體分析研究中，最能展現出它的優勢。
但是，也就因為第三代定序只針對單一的DNA分子進行定序，不像NGS能夠以增加定序深度（Sequencing Depth）來提昇定序的品質，因此仍然具有較高的錯誤率（5～30%），主要應用在一些植物和微生物的新物種基因序列分析或是容易發生甲基化的高重複性基因序列（CpG island），目前多用於研究用途，尚未出現成熟的臨床應用（有部分研究將三代基因定序應用於HLA-genotyping）。
第三代定序比較具有代表性的平台包括較早期的Helicos Bioscience的tSMS（True Singte Molecuve Sequencing）、Pacific Bioscience的SMRT（Single Molecule Real-Time sequencing）和後期異軍突起的Oxford Nanopore Technologies。（如表二）
總之，第三代定序目前雖然技術上已漸趨穩定，但由於定序成本仍然偏高，目前多僅只有用於需要精準解讀長片段重複序列的研究用途（動物、植物、微生物的新物種de novo定序）和表觀遺傳學（Epigenetics）的基因修飾（例如：甲基化）研究。
結語
次世代定序的優勢在於強大的定序效能，能夠同時定序數百萬個基因片段，並透過生物資訊的演算方法進行拼接，適合發展大範圍的廣泛性篩檢，目前最成熟而廣泛的應用莫過於非侵入性胎兒染色體基因檢測（NIPT/NIFTY/NIPS），還有針對基因遺傳疾病和遺傳性癌症的廣泛性帶因篩檢（Expand Carrier Screening），甚至是全外顯子定序（Whole Exon Sequencing; WES）和全基因體定序（Whole Genome Sequencing；WGS），都非常適合採用次世代定序的技術平台。
尤其在癌症醫學方面，面對個人化量身訂做的精準醫學時代，健保署也因應世界趨勢，即將核准次世代基因技術之健保給付，相信將來次世代基因定序檢測的應用與需求，與日俱增，對於癌症診療必然扮演極重要的角色。