張金堅:液體切片在癌症診療扮演的角色
本文摘自＜常春月刊＞502期
文／張金堅
任何實體腫瘤都是透過組織病理切片進行確切的診斷，然而腫瘤組織切片會造成組織傷害且操作起來相對複雜，對於一些術後或轉移性癌患者來說，腫瘤體積太小、分散或腫瘤位置，有時並不適合進行組織切片。另外，組織活檢只能反映腫瘤在某一時間點的局部狀態，這樣可能會錯過某些腫瘤突變的資訊。液體切片是指從體液（包括血液、尿液、胸水、腹水、淚液及唾液等）中，獲得來源於各種組織的生物標誌物，並通過對所得的生物標誌物進行分析得到其來源組織的相關資訊。
液體切片的方便性，可以重複檢查、可用來追蹤、沒有疼痛、風險較低，受檢者不會恐懼，在腫瘤領域具有極大潛力和廣泛臨床應用價值。液體切片這個名詞是Alix-Panbieres和Pantel在2010年首次發表的，當時是用來描述血液循環腫瘤細胞（Circulation Tumour Cell, CTC），但很快的，這個名字就擴大到血液循環腫瘤DNA（Circulation Tumour DNA, ctDNA）。雖然早在1869年Thomas Ashworth就提出CTC的概念，而一直到1948年才有法國科學家Mandel等人描述ctDNA。然而，CTC的高偽陽性和高偽陰性限制了它的臨床實用性，而讓ctDNA後來居上，成為液體切片的主角。
在臨床腫瘤學中，首次驗證ctDNA則是2014年檢測大腸癌患者中的KRAS／BRAF突變，然後在2020年，將ctDNA用於檢測非小細胞肺癌中EGFR基因的突變，而後相繼有其他癌症包括乳癌等之相關報告。本文將從液體切片在癌症的篩檢、早期診斷、監測病情變化、預測預後、探索耐藥機制，以及新藥研發等方面進行闡述，並與讀者分享。
液體切片主要檢測對象
❶循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）
ctDNA是指人體血液循環系統中不斷流動的攜帶一定特徵，包括突變、缺損、插入、重排、轉位、拷貝數異常和甲基化等來自腫瘤基因組的DNA片段；ctDNA的主要來源包括：壞死的腫瘤細胞、凋亡的腫瘤細胞、循環的腫瘤細胞、腫瘤細胞分泌的外泌體。當癌細胞壞死或凋亡時，釋放出漂浮在血液中的基因組片段，即ctDNA。在晚期癌症患者中，腫瘤可能是血液中大部分循環游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）的來源；ctDNA是一種敏感性和特異性較強的生物標誌物，廣泛應用於多種不同類型腫瘤的臨床研究。
但由於ctDNA所占比例較小，從正常cfDNA中難以區分ctDNA，對樣本中突變片段數量進行準確定量存在很多困境，因此，需要靈敏度和特異性較高的檢測方法。
過去DNA測序方法主要是第一代DNA測序方法，近年來，隨著次世代基因測序（next-generation sequencing, NGS）技術和數位PCR（digital PCR, dPCR）技術的發展，改變了檢測ctDNA的層級。目前，對於已知突變的ctDNA主要檢測技術有dPCR技術，及基於小珠、乳濁液、擴增和磁性（bead, emulsion, amplification and magnetic, BEAMing）的技術，以及突變阻滯擴增系統PCR（amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR）技術，利用上述技術，可以分析DNA片段所得的訊息，其中包括腫瘤的基因突變、染色體異常、複製體變異和甲基化等狀態。
此外，ctDNA的含量與腫瘤體積有高度相關性，因此可作為腫瘤大小和分期的替代指標；同樣的，有研究證明ctDNA含量的起伏與疾病的進程高度相關，對於許多種類的癌症，它是一種有效而且非侵入性的療效監測方法。
ctDNA的應用範圍廣泛，包括早期癌症篩查、疾病監視、治療選擇和預後評估等：
◎早期診斷癌症：由於早期癌症往往無明顯症狀，難以被發現；ctDNA可以偵測出微小腫瘤細胞的存在，有助於癌症的早期發現和診斷，進而提高治療成功率。
◎長期監控癌症復發：對於第一到第三期的癌症患者，ctDNA可長期監控癌症是否復發。術後追蹤過程中，通過定期抽血檢測ctDNA，可以偵測血液中的突變基因比率的變化，提早發現復發跡象，並及早調整治療方案。
◎監控治療成效：由於液體切片是基於血液樣本的檢驗，因此可以在病人的整個治療過程中反覆進行，以便監控病情的變化。對於第四期的癌症患者，ctDNA能夠評估治療反應和換藥的時機。治療一段時間後，癌細胞可能產生抗藥性，ctDNA的數據及資訊可協助醫師評估治療成效，並及時調整藥物。
◎新藥研發：ctDNA能偵測特有的基因突變，如果有藥廠發展出相對應的治療藥物，就有機會增加療效。（如圖一、表一）
❷循環腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs）
CTCs是從原發性或轉移性腫瘤組織流入周邊血液的罕見癌細胞，這些CTCs的表型和遺傳特徵，可以幫忙癌症分期和治療提供重要資訊，因此，進一步研究它們的特徵和性質，是一個相當有應用價值的醫學領域，也為液體切片提供細胞來源。在周邊血液中，約每106個-107個白細胞中可能僅有1個CTCs，因此CTCs富集（濃縮）分離（enrichment）是關鍵所在。CTCs檢測基本過程是先對其進行分離富集（濃縮），再進行分析。富集（濃縮）和分析的方法基於CTCs的物理和生物學特性，例如大小、變形性、密度、極性和電荷、上皮細胞黏附分子、細胞角蛋白和表達的腫瘤相關標誌物。
CTCs富集（濃縮）的方法主要有：密度依賴性細胞分離、基於細胞大小的分離、基於磁泳移動性的分離、免疫磁珠陽性富集（濃縮）和通過微流體裝置富集（濃縮）。目前唯一獲得美國FDA認證核可使用於臨床之CTC監測系統為CellSearchⓇ平台，即為使用EpCAM作為偵測標的。
CellSearch平台以半自動化磁珠篩選帶有EpCAM標記之細胞，並再以免疫螢光染色標定CK8、CK18、CK19，去除掉表現CD45之白血球，並以DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole，實驗室常用之DNA染劑）標記細胞核，進行全套CTC之篩選和純化，進化後即可進行量化測定。目前進行幾個臨床試驗中（例如TREAT CTC Trial），CellSearch平台在病人檢體中有得到一定程度的再現性之確認。綜合了體外及臨床檢體之分析，方得到現行通用之CellSearch平台轉移性癌症CTC門檻的數值，即每7.5cc血≧5 CTC。然而，CellSearch平台並非完美無缺點。
就原理上來說，CellSearch平台測得為帶有EpCAM之CTC。因此若由CTC表現較低密度或不表現EpCAM，就可能難以被CellSearch平台偵測。而CTC上EpCAM之表現量也有研究指出，有一定程度變異性，也可能隨時間變化，造成使用CellSearch平台判定之盲點。這也是CTC技術若要能更全面廣泛應用於癌症治療還需要克服的一大挑戰。（如圖二）
❸外泌體
1983年，外泌體最先在綿羊的網織紅細胞（未成熟的紅血球佔所有紅血球中只有1%，英文叫reticulocyte）中被發現，外泌體是一種細胞源性囊泡，直徑為30nm～100 nm，它可以從血漿、唾液、尿液、乳汁、胸水、腦脊液和精液等多種體液中檢測到其內含有的蛋白質（如細胞因子、生長因子）和miRNA等生物活性物質，通過對腫瘤外泌體的檢測分析，可以得到腫瘤細胞的相關資訊。
外泌體提取的方法有：差速超速離心法、PEG沉澱法、聲波分離法、密度梯度離心法、過濾離心法、吸附法和免疫磁珠法等。外泌體的鑒定方法包括：電子顯微鏡、免疫膠體金標記技術、即時螢光定量聚合酶鏈式反應、流式細胞儀、奈米顆粒追蹤分析技術和測序等。
如上所述，外泌體除已經發現含有蛋白質外，外泌體中還含有大量的mRNA、miRNA、circRNA和DNA片段等核酸成份（如圖三），由於這些內含物提供了豐富的生物資訊，可以多方位、多角度的揭示出疾病（心血管、腎臟、神經退行性、代謝疾病和癌症）資訊，因而逐漸成為癌症生物標誌（biomarker）以及非侵入式液體切片（liquid biopsy）的新研究對象。
此外，以同樣應用在液體切片（liquid biopsy）的主種檢測標的進行比較，比起循環腫瘤DNA（Circulating tumor DNA, ctDNA）分離技術相當簡單和成熟，但是其為片段的DNA，並不是完整的基因資訊；而循環腫瘤細胞（Circulating Tumor cells, CTC）含有的資訊雖然較多且完整，但是因為數量很少，要從血液中分離出來，困難度較高，因此目前多用於研究。
而外泌體的來源廣泛，例如淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞及上皮細胞、腫瘤細胞等，都可以分泌外泌體，所分泌出的外泌體還會進入羊水、腹水、唾液、血清、血漿、母乳、尿液、精液、腦脊髓液和眼淚等諸多生物流體，因此極大的拓展了檢測途徑，提供了診斷易用性和加快檢測速度，也促使針對外泌體的「液體切片（liquid biopsy）」的發展，癌細胞的外泌體內含物與正常細胞不同，均可能成為癌症特有的生物標記。
以乳癌為例探討循環腫瘤細胞（CTCs）在診療上的應用
❶CTCs對於早期乳癌的角色
由於早期乳癌在周邊血液中，CTCs數量極少。到目前為止，在輔助化療方面尚無法證實在早期乳癌病人周邊血液中有CTCs的預後較差；但在術前進行化療方面，即所謂新輔助治療，於2018年有一項利用CellSearch平台大規模綜合分析了21個醫療中心，共計2774名病人，發現25.2%病人在化療前抽血有≧1顆CTC，與腫瘤大小相關、存活期、復發率都有顯著相關，但CTC數目與病理完全緩解無統計上的相關性。
❷CTCs對於晚期乳癌的角色
從2004年就有研究證實，在7.5cc全血中≧5顆CTCs的晚期乳癌病人預後較差。到2014年亦有一合併分析（pooled analysis），共納入1944名病人，亦證實同樣的結果。到目前為止，CTCs在轉移性乳癌已獲美國FDA證實對於預後及存活期的評估有其效力；但根據CTC數目變化而調整治療方式的策略，目前尚無共識，故FDA或各大癌症醫學會尚未將CTC納入治療選擇流程的評估指標。
❸Her-2表現在乳癌病人CTC扮演的角色
根據DETECⅢ第三期臨床試驗及CirCeTDM-1第二期臨床試驗，如果病理組織為Her-2陰性，但在周邊血液測得Her-2陽性的CTC時，使用抗Her-2之標靶藥物，則有較長的存活期，可見CTC如果轉變成Her-2陽性的話，要考慮使用對抗的標靶藥物。
液體切片面臨的困境與挑戰
儘管液體切片有許多利基，但是它也有一些限制與困境。第一，這些方法還不能提供腫瘤的所有訊息，諸如它不能提供腫瘤的確切位置或大小，目前的技術還不能確保獲得所有ctDNA的資訊，這可能會導致一些重要訊息的漏失。目前雖有美國FDA核准之二種ctDNA的檢測，還有一種CTCs的檢測，但到目前尚無統一的標準進行收集和分析ctDNA和CTCs，這可能會導致結果的不準確。
另外與液體切片相關的臨床試驗數據相對不多，因此，需進一步多發展與液體切片有關的臨床試驗，才能確定其在臨床上的實際效果。到目前為止，仍無法獨當一面在癌症的篩檢、診斷和監測方面扮演重要角色，仍需與其他檢測方法結合使用，才能獲得完整的訊息，有時在CTCs或ctDNA中發現抗藥性的機轉，但無對應的藥物可用。加上CTCs經過多體學的資料呈現，但仍有許多無法像傳統病理檢查能夠全面完整解釋，更值得一提的是所需檢測的步驟和程序非常繁瑣，而且費用非常高昂亦是要面對的挑戰。
結語
液體切片是一種新興的癌症檢測技術，目前較廣泛應用在周邊血液。其實在身體的各類體液亦具有潛力，像淚水、汗水、尿液、胸水、腹水，甚至乳汁、大便亦具有實用價值。它在篩檢、診斷、疾病進展、治療監測、復發預測、抗藥性機轉研究，乃至新藥研發都可以當作生物標記使用，將來可應用的範圍非常廣泛。
如果加上把人類CTC注射到老鼠身上長出腫瘤，亦可作為藥物效用的篩查。還有多體學及人工智慧的應用，及液體切片本身技術不斷的精進，將來必能更正確、更快速地預測癌症的發展，進而提供更多的治療方案，而且可以了解各種藥物抗藥性的機轉，可能衍生更多新藥的研發，改善病人的存活期及生活品質。（如圖四）、（圖五）
（圖片來源：Dreamstime/典匠影像）