張金堅：癌細胞的酸性環境使腫瘤更難纏
本文摘自<常春月刊>497期
文／張金堅
眾所周知缺氧與過酸是腫瘤微環境之兩大特徵。早在20世紀初期，迄今已超過半個世紀，相繼有許多科學家探討缺氧與癌症的關係，西元1923年德國生化學家瓦伯格提出「癌症是由細胞的呼吸系統缺氧引起」的理論，即所謂「瓦伯格效應」，他也因此獲得1931年諾貝爾生醫獎，其理論不一定完全正確，直到半個世紀以後，相繼由美國波士頓Dana-Farber Cancer Institute的William Kaelin博士、巴爾的摩John Hopkins大學Gregg Semensa博士及英國牛津大學Francis Crick Institute的Peter Ratcliffe各自發現的蛋白質，包括人類及動物在缺氧環境下，在上、中、下游的蛋白質（VHL, HIF-1及EPO）會「一條鞭」式地反應，以適應缺氧，像癌症腫瘤在快速生長中，處於缺氧環境。
這三位科學家開創性的發現在2019年終於獲得諾貝爾生醫獎，見證腫瘤及附近微環境在缺氧時，其細胞間質造成酸性狀態。根據最近研究的報告證實，其酸性程度比以前想像更低（約pH5.3），其造成酸性過高的原因，可能來自癌細胞之高代謝活性及血管新生的灌流功能不佳，導致腫瘤微環境之H+離子及乳酸增加，此等酸性環境部分可能活化細胞間質中金屬蛋白酶等的增加，導致癌症侵襲性更大，進而轉移，並且抑制殺死腫瘤的免疫細胞（如毒殺性T細胞等）。
過去都認為癌細胞會缺氧，導致周圍組織酸度變高，所以大家多把「酸性腫瘤微環境」認為是被動，只是扮演附帶乘客（Passenger）的配角角色，不是驅動者的主要角色。但這20多年來的諸多研究報告均強烈指出，腫瘤微環境與缺氧有一定的關係，但造成酸性環境，不一定互為因果，也不一定正相關，而且酸性癌細胞不一定全部進行糖解作用（glycolysis），也還是有利用細胞內氧化磷酸化反應（Oxidative Phosphorylation，縮寫OXPHOS）。所以近年來有關癌細胞的酸性環境的研究非常熱門，而被認為是癌症的重要特徵之一。
本文將針對癌細胞及其鄰近環境造成酸性變化的原因及造成腫瘤坐大導致轉移，還有衍生免疫抑制的各種狀況，分別一一介紹，與讀者分享。
酸性微環境形成的原因
由於腫瘤剛形成時，大小在1～2mm3 左右，癌細胞之成長，只需靠細胞間的擴散作用，就可直接吸收周遭環境的養分或排除代謝廢棄物即可存活，然而一旦腫瘤生長大小超過3mm3，就必需倚賴血管新生的建構來提供腫瘤生長的環境。這些快速新生的血管網絡與正常血管構造不同，功能亦有不同，會干擾血液與氧氣的充足供應，導致缺氧狀態，無法像正常的細胞利用粒線體進行細胞氧化磷酸化反應，其代謝過程必須重新調整，利用大量的葡萄糖進行糖解，產生丙酮酸（Pyruvate），以致累積大量乳酸及H+離子。
而且更有甚者，這些缺氧狀況造成酸性在腫瘤微環境，並非一致性，腫瘤微環境靠近血管分佈的地方，其缺氧不嚴重，pH值較正常，但距離血管中等程度距離的微環境，因其中代謝機轉可能比較複雜，反而造成高度酸性環境。一部分在細胞粒線體內進行檸檬酸循環（TCA）氧化磷酸化反應，另一部分在細胞質內進行糖解。至於距離血管分佈最遠處，其缺氧最嚴重，則純由細胞質進行糖解作用（glycolysis），其酸性是中等程度強。（圖一）。
說明：表示離血管最遠的深度缺氧的區域，因缺氧使氧化磷酸化反應(OXPHOS)無法作用，而令癌細胞需要高度依賴糖解作用，釋放乳酸和H+離子。在本圖中間，屬於中度缺氧區域，包括胺基酸（如麩醯胺酸Gln）、脂肪酸（FAs）及乳酸（從癌細胞高度糖解作用釋出）等各種受質有助於檸檬酸循環（Citric Acid Cycle，又稱三羧酸循環TCA Cycle）和氧化磷酸化反應（OXPHOS）提供燃料，從而產生二氧化碳（CO2）。CO2經細胞膜擴散後，進行水合作用，生成H+離子和碳酸氫鹽離子（HCO3¯），導致pH值降低，造成高酸性的區域。在本圖上方，由於靠近腫瘤血管附近，在含氧量正常的情況下，二氧化碳從癌細胞排放到血流非常容易，使pH值較高，接近中性。
癌細胞在酸性微環境下如何壯大自己
由上面敘述證實，癌細胞所處之酸性環境有些與缺氧共存，但有些微環境所處之酸性氛圍，亦有自己扮演的角色，諸如細胞間質的改變，使金屬蛋白酶活化等，另外，因細胞外間質酸性情況下，會使腫瘤細胞會有表皮間質化（EMT）的改變，導致癌細胞更分化不良，惡性度更高，另有VEGF-A及IL-8的活化使血管新生，但腫瘤產生的血管構造不良，缺口甚多，造成組織灌流不足，還有在酸性情況亦會活化VEGF-C使淋巴管的生成亦成紊亂的狀況。加上細胞外液在酸性情況會壓迫新生成的淋巴管，導致淋巴液循環不佳，而且酸性細胞外液會使癌細胞朝幹細胞發展，使得癌細胞更具韌性，對化療及放射線治療具有阻抗作用，導致治療效果不佳，加上會增加P-醣蛋白（P-glycoprotein）的活性，進而造成多重化療藥物抗藥性（MDR）。
其他影響很多細胞外液的各類蛋白（如切絲蛋白、絨毛蛋白等），使得癌細胞造成極化現象，導致癌細胞的移動性增強，向外侵襲能力增加。其他還會阻止癌細胞的凋亡，而且活化癌細胞的自噬現象（Autophagy），使自噬後的產物，可以透過再回收（Recycle）的機轉，使癌細胞可以存活更多的細胞，也使存活的時間變得更長，促使腫瘤越長越大，如（圖二）。其他還會抑制免疫，會使殺死癌細胞的毒殺性T細胞（Cytotoxic T Cell）、輔助性T細胞（Helper T cell）及自然殺手細胞（Natural Killer Cells）的功能無法發揮。反而使助長癌細胞坐大的免疫抑制細胞，像調節性T細胞（Regulatory T cell, Tregs）、骨髓衍生抑制性細胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）及M2巨噬細胞的產生，這種免疫抑制在酸性環境更形顯著，詳細情形如下段分析。
腫瘤酸性環境造成免疫抑制（Immunosuppression）及免疫逃脫（Immune Escape）
如前所述腫瘤酸性環境，除了上述使腫瘤的分化不良，導致局部侵襲加強及加速轉移外，對於免疫抑制亦造成甚大的影響。一般而言，主要殺死腫瘤的免疫細胞，包括毒殺性T細胞、自然殺手的細胞等，在酸性環境下不易存活，甚至喪失毒殺腫瘤的功能。另外，同樣具有毒殺腫瘤功能M1巨噬細胞，或幫助認識腫瘤抗原的樹突細胞，均因環境過酸失去原有的功能。
此外，對應腫瘤抗原產生的抗體亦會因降解、氧化，使抗體結合抗原的能力降低，導致抗體完全無法發揮應有的作用。另外，會造成免疫抑制的M2巨噬細胞、骨髓衍生抑制性細胞及調節性T細胞，因酸性環境其數目及功能反而增加，也相對使免疫抑制作用更形明顯，使腫瘤持續擴大，詳如（圖三）。
說明：低pH值在腫瘤微環境中可作為癌細胞的「全面保護盾」，猶如一道「酸牆」。正如圖中文字所示，腫瘤酸性環境提供了全面性的免疫逃脫機制，利用此機制消除或減弱所有對抗腫瘤免疫細胞（包括毒殺性T細胞、自然殺手細胞和關鍵的抗原呈現細胞，如樹突細胞）。其數目及活性均降低，同時有利於腫瘤生長的調節性T細胞和骨髓衍生性細胞及促癌巨噬細胞（M2巨噬細胞）反而活化，此等會使抑制腫瘤生長的免疫作用減弱。
今年三月在《Nature Biomedical Engineering（自然生物醫學工程）期刊》，亦有更新的研究報告，此報告由德州大學西南醫學中心Dr. Jinming Gao領導的研究團隊發現，癌細胞會將糖解作用產生的乳酸從癌細胞泵打出來，進入癌細胞外之微環境，在腫瘤邊緣形成酸度較高的區域，進而出現一道隱形的酸牆（acid wall），這道酸牆可以阻止毒殺性T細胞（CD8+T細胞）進入腫瘤，所以腫瘤不會被此等毒殺性T細胞等攻擊，使腫瘤長得更大。
另外，此研究團隊亦在過去的研究中發現在體外試驗，將癌細胞與毒殺性T細胞一起培養，將培養皿之pH降至5.3，在3小時後，發現毒殺性T細胞全部死亡，而癌細胞仍然活得很好，此發現充分證明酸性環境會使可以攻擊腫瘤的免疫細胞消滅，使得對抗腫瘤的免疫功能減弱。
如何量測腫瘤微環境的酸度及其臨床應用
人體動脈血液的酸鹼度，其正常範圍相當的窄小，大約從7.36至7.44，但人體的橫紋肌肌肉細胞，因應劇烈運動，產生乳酸，pH可降至7.04，但經休息5.2分鐘，pH馬上恢復至7.4。至於惡性腫瘤的微環境其酸鹼範圍較廣。早期在雞的勞氏肉瘤病毒（Rous chicken sarcoma）利用pH電極，可以偵測細胞外液的酸度從6.32至6.89。
在人的乳癌、肺癌等腫瘤，亦可利用pH電極可偵測酸度6.72至7.01之間，後來磁振造影（MRI）合用小分子pH感測器可測得pH6.4至7.3之間，但這些檢測仍有侷限，較欠缺空間解析度。
後來Dr. Jinming Gao等人設計了可在特定酸度下發光的奈米粒子，像pegsitacinine這種螢光顯像分子的奈米成分，可在pH5.3的腫瘤中發現明亮螢光，才知道腫瘤微環境酸度可低到5.3。由於此發現，不但可以精準量測腫瘤微環境的酸鹼度，另外利用螢光可以精準探測腫瘤的所在位置，而且與周遭的正常組織分開，成為癌症手術中可以正確引導切除腫瘤範圍的有效工具。在2023年pegsitacinine已獲美國食品藥物管理局（FDA）通過，可以靜脈注射，然後會在腫瘤部份呈現螢光，使外科醫師可以明確界定腫瘤的範圍予以切除，且與後續病理檢查對照，發現切除的準確度極高，如（圖四）。
說明：當組織從健康狀況轉變為侵襲性癌症時，腫瘤微環境會轉變成酸性。ONM-100奈米粒子由於腫瘤新生血管構造不全，缺口甚多，造成高滲透而外滲。另外淋巴管生成亦不健全，導致淋巴返流不佳，使得ONM-100在酸性細胞外基質中聚集，導致低pH活化，ONM-100的螢光，從「關閉」（綠色）狀態轉換成「打開」（紅色）狀態。 pHe：細胞外pH；pHt：閾值pH。所以紅色的奈米粒子會聚集於腫瘤處。
如何克服腫瘤酸性環境達到治療效果
綜上所述，癌細胞需要很多代謝能量，造成癌細胞微環境中乳酸及H+離子的累積，加上新生的血管構造不全，功能不彰，是H+離子在細胞外液累積更多。另外，癌細胞大量利用糖解反應使乳酸的廢棄物增加，除了糖解作用，癌細胞亦會利用與正常細胞一樣在細胞粒線體進行氧化磷酸化反應，產生的CO2亦會透過水合作用（hydration）產生氫離子造就酸性環境的惡性循環。
所以，要阻斷酸性環境持續惡劣，一定要以下列三種方式進行：（一）針對癌細胞的pH調節系統進行干擾，（二）進行緩衝療法（Buffer treatment），（三）亦可使用pH敏感藥物傳遞系統來改變酸性狀態，詳述如下：
針對癌細胞的pH調節系統進行干擾
由於癌細胞處於空間的非均勻性，腫瘤的酸性環境不盡相同，所以其酸性的濃度範圍有高有低，pH的調節系統非常多元，包括（i）CAIX, CAII系統、（ii）NBSc系統、（iii）MCTs系統、（iv）NHEs系統、（v）ATPase系統（詳見圖五）（下頁），都可能是腫瘤微環境酸性化的調節系統，如針對各系統找出抑制劑，則可改善酸性環境，直到達到消滅腫瘤的目的，如（圖五）左側― 所示之抑制，都是目前臨床試驗正在進行，所使用的抑制劑。
緩衝液療法
可以透徹全身性給予中和pH的緩衝物，如lysine、imidazole及NaHCO3等，到目前為止，亦有多項研究，顯示可以強化免疫作用，使殺死癌細胞的CD8+T細胞增強，亦可使化療及放射線治療之療效加強，如（圖五）中間― 所示。
使用pH敏感藥物傳遞系統
利用低pH可插入的胜肽（pH low insertion peptide，pHLIP），在不同pH的情況可與腫瘤細胞膜的雙脂層接觸，可以利用嵌入（pH=6.4）或插入（pH<6.4）的方式進入細胞，亦可攜帶化療藥物進入細胞，可以改變或適應癌細胞及其環境的酸性狀況，亦是一種可行的治療模式，如（圖五）右側所示。
說明：
（a）顯示主要的pH調節轉運蛋白和酵素，以及對應的藥理抑制劑。箭頭表示運輸和/或催化反應的方向，主要包括，H+轉運蛋白是鈉氫離子交換蛋白（Na+-H+ exchanger，簡稱NHE）、單羧酸轉運蛋白（MCT）和H+-ATP酶，而HCO3¯轉運蛋白主要包括Na+/HCO3¯共同轉運蛋白（NBC）。
（b）用系統緩衝物中和腫瘤衍生的酸，除了對細胞外pH可以中和外，亦可限制弱鹼性化療藥物解離，提升藥效，並可加強毒殺性T細胞功能，使免疫檢查點抑制的功效提升。
（c）低pH可插入的胜肽 (pHLIP)在水溶液中是可溶且非結構化的（狀態一），可與細胞膜的磷脂雙層結合。在嵌入狀態二（pH = 6.4），pHLIP可嵌入。甚至在狀態三中，（pH < 6.4），可更深地插切入雙層結構中，pHLIP將其C端插入細胞膜，形成穩定的跨膜α螺旋。
結語
腫瘤微環境的酸性狀態，雖然有時與缺氧共存，但絕非配角，在目前的多項研究證實，「酸性微環境」已在癌症特徵佔一席重要地位，扮演主角的功能。其造成腫瘤侵襲性增強或加速轉移，部份機轉與缺氧相同，但對化療及放射治療效果減弱的作用機轉則不盡相同。至於其他抑制細胞凋亡、強化細胞自噬、幹細胞的韌性增強及造成表皮間質化（EMT）亦是腫瘤微環境酸化的特色。
更重要的是會抑制毒殺腫瘤的免疫力，猶如在腫瘤周圍形成一道「酸牆」（acid wall），阻止人體免疫細胞攻擊，這些特徵在近20年來，已引起諸多科學家及臨床專家的重視，針對腫瘤的酸性環境的克服，已相繼有很多臨床試驗陸續進行，可望將來可以開發很多有用的新藥，來解決癌症酸化的難題，使癌症治療更邁進一大步。
（圖片來源：Dreamstime/典匠影像）