基因編輯教母珍妮佛道納訪台演講，細述 CRISPR-Cas9 系統
基因編輯（Gene Editing）這項革命性的科學發明，近年來在全球的基礎研究與應用掀起遍地烽火，受到史無前例的關注。第 13 屆 Sunney Chan Lecture 特別邀請 CRISPR 基因編輯教母珍妮佛道納（Jennifer A. Doudna）教授再次造訪台灣在中央研究院進行演講，講述《CRISPR 生物學如何引領基因編輯的未來 》（CRISPR Biology Guides the Future of Genome Editing），將 CRISPR-Cas9 系統的過去與未來完整地做了完美的詮釋。
誤入夏威夷叢林的小女孩 畢生投入基因體研究
Sunney Chan Lecture 主席 Sunney Chan 教授在引言時介紹，Jennifer A. Doudna 出生於美國華盛頓特區，生長在一個充滿學術氣息的家庭，父親和母親分別在英國文學和東亞歷史擁有博士與碩士學位，並分別都在大學與學院任教，是名符其實的書香門第。因為父親任教工作的關係，在她 7 歲時舉家遷移到夏威夷，夏威夷島上豐富且獨特的生物型態，引發了童年時期的她對生物學的好奇和興趣，更在她心中埋下了科學研究的小小種子。到了中學時期，從她父親贈與諾貝爾獎得主詹姆士華生（James Watson）的著作《雙螺旋：發現 DNA 結構的故事 》（The double helix）獲得啟發，深深被這完美對稱的雙股螺旋結構當中的生命奧祕所吸引，進而投身於生物科學研究領域。
在她大學求學時期，分子生物學的中心法則（The central dogma of molecular biology）邏輯剛被確認，RNA 被認為是很單純的遺傳訊息傳遞物質，但後來科學家們發現 RNA 並非完全按照 DNA 密碼轉譯而成，而是具有許多非轉錄 / 轉譯的功能性結構，進而引發她的興趣投入 RNA 領域，長年鑽研 RNA 相關的細胞分子機轉研究。
因緣注定遇見妳 與 CRISPR 的不解之緣
Jennifer A. Doudna 教授回憶起 2006 年時，在加州大學柏克萊分校（University of California, Berkeley）同事班菲爾德（Jillian Banfield）的引領之下，首度認識 CRISPR，讓她開始對這個發生在古微生物的有趣現象感到興奮且深深著迷，但實際上當時她因為研究室的資源和人力不足，險些放棄這項嶄新而高風險的 CRISPR 研究。在班菲爾德的強力鼓吹之下，再加上團隊有新的博士後研究員威登赫夫特（Blade Wiedenheft）的加入，讓她決定放手一搏，決心投入探索 CRISPR 神祕機轉的謎團。
2011 年，CRISPR 研究發生了巧妙的化學變化，在一場國際研討會的場合，Jennifer A. Doudna 教授因緣際會認識了法國的微生物學家伊曼紐夏彭提耶（Emmanuelle Charpentier）博士，兩人相談甚歡決定開始合作。Emmanuelle Charpentier 從化膿性鏈球菌的感染機制確認是以第 II 型 CRISPR 系統來切斷病毒 DNA，其中 csn1 基因扮演非常關鍵的角色（Csn1 曾有過許多名字，直到 2011 年夏天才被正式命名為 Cas9）。她們一致認為 Cas9 蛋白可能在第 II 型 CRISPR 系統的免疫反應期間，擔任破壞病毒 DNA 的關鍵要角。
CRISPR 的全名是「常間回文重複序列叢集／常間回文重複序列叢集關聯蛋白 / 群聚且有規律間隔的短回文重複序列」（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins），主要為一種存在於大多數細菌與所有的古細菌中的後天免疫系統，負責消滅入侵的外來質體或者噬菌體，在所有原核生物的重複 DNA 序列中，CRISPR 似乎是最為普遍的一種重複 DNA 序列家族。
CRISPR-Cas 基因編輯系統是由兩段 RNA（CRISPR RNA 和 tracrRNA）和切割酵素酶蛋白（Cas9）所組成的複合式結構，CRISPR RNA 和 tracrRNA 扮演導航者的角色，帶領著 Cas9 蛋白複合體找到病毒的 DNA 序列進而將其切割分解。2002 年，揚森（Ruud Jansen）所帶領的研究團隊以英文字母縮寫組合出 CRISPR 的稱號來為這區段命名。CRISPR / Cas 的複合式結構包含兩個部份，第一個是 CRISPR，這是一段排列奇特的 DNA；第二個是 Cas，是一種核酸酶。這兩者組合起來就成為一套 DNA 編輯系統。
▲ CRISPR-Cas 基因編輯的 3D 列印模型。
基因編輯的聖盃 CRISPR / Cas9 帶起研究應用狂潮
Jennifer A. Doudna 教授說明在基因編輯系統中 CRISPR RNA 是一段約 20 個核苷酸長度的 RNA 序列，透過序列互補來辨認目標 DNA 的位置，讓 Cas9 蛋白進行雙股 DNA 切割裂解（Double Strand Break），進而透過細胞本身的自然 DNA 修復機制，或是給予人工的外源 DNA 片段做為模板，對於目標 DNA 序 列進行修補或是編輯。2012 年，她與美國加大柏克萊分校的同事 M. Jinek 和 Emmanuelle Charpentier 合作，嘗試把 CRISPR RNA 和 tracrRNA 接合起來，變成一條合成的單股 RNA，稱 sgRNA，大幅簡化了製作 CRISPR / Cas9 的過程。該研究成果旋即發表在《Science》期刊，並且在隔年的 1 月份發表了 CRISPR 基因編輯在人類細胞的研究成果，不僅奠定 CRISPR / Cas9 成為基因編輯的重要里程碑，更點燃 CRISPR 基因編輯研究 / 應用領域群雄並起的烽火。
Jennifer A. Doudna 教授認為，CRISPR-Cas9 系統具有的三大特性，使得其機轉和應用逐漸受到重視：
可控制 / 編輯欲鎖定的目標 DNA 序列。
能在基因體當中進行快速地掃描與編輯。
不僅在基因編輯能夠使用，還能用於基因轉錄的控制（Transcription control）甚至偵測細胞中特定基因變異位點的存在與否，用途非常廣泛。
除了 Cas9 系統，她的研究團隊還試圖探尋是否還有新的 CRISPR 系統的存在，2017 年她和 Burstein 教授團隊合作，證實在微生物體當中還有其他的 CRISPR 機制存在：CRISPR–CasX 和 CRISPR–CasY。實驗證實 CasX 確實能在 CRISPR 系統發生作用，可能將是繼 Cas9 之後，另外一個具有潛力做為基因編輯應用的工具，值得進一步研究探討。
Jennifer A. Doudna 教授在演講中也不諱言地直接點出，基因編輯應用在臨床醫療所面臨的挑戰包括：CRISPR 系統和模板 DNA 的傳遞效率、如何精準地控制 DNA 修復的途徑和道德倫理的爭議。目前已經在研究（Reaserch）、健康照護（Healthcare）、治療（Therapeutics）、農業（Agriculture）和診斷（Diagnostics）等六大領域開展了許多應用。
研究領域方面，運用 CRISPR 基因編輯技術來探討蝴蝶翅膀的顏色與型態變化，或從基因演化的角度來研究古代尼安德塔人的腦部發育和現代人類的腦部差異。器官移植也是 CRISPR 基因編輯健康照護方面很有意義的應用，由於豬隻與人類的體積相近，是非常好的器官移植捐贈來源，但來自於豬隻本身的反轉錄病毒（Porcine endogenous retrovirus），具有感染並插入人體細胞 DNA 的風險，可能造成無法預料的 DNA 突變風險。近年來有研究團隊運用 CRISPR/Cap9 的基因編輯方法將器官組織的細胞重新編程（Reprograming）來弱化內生性的反轉錄病毒活性，讓異種移植（Xenotransplantation）的可行性又向前邁進一大步。
在疾病治療方面，CRISPR 在一些重大的單基因遺傳病例如：亨丁頓舞蹈症（Huntington’s Disease）的治療上，從老鼠的動物實驗當中也獲得了重大的進展，相關的神經退化疾病：例如帕金森氏症（Parkinson’s disease）或阿茲海默症（Alzheimer’s disease）未來也有機會透過此機制做為治療策略。在農業方面，有研究團隊將 CRISPR 應用於蕃茄種植，將 MADS 基因序列轉殖到植株當中，能有效地提升作物產量，將可能有助於人類減緩糧食不足的危機。在臨床診斷方面，麻省理工學院（MIT）的張鋒（Feng Zhang）教授團隊運用 Cas12a 的 CRISPR 系統開發出一種能夠偵測特定基因序列的檢測方法，透過螢光標記將偵測到特定基因序列的反應呈色，能夠廣泛使用在 SNP 位點的偵測、腫瘤的早期篩檢、細菌感染源檢測、抗生素的抗藥性反應和病毒感染源檢測等方面，由於試紙輕便攜帶方便且容易檢測，未來有機會應用於定點照護檢測（Point of Care Testing，POCT）的疾病篩檢與診斷。
面對基因編輯的倫理爭議 研究之路任重而道遠
由於道德倫理爭議的禁錮，基因編輯的應用目前大多僅止於在動植物的活體實驗或人類細胞的體外實驗當中獲得印證，要進一步在人體進行實驗或應用，仍有許多問題需要被克服。
Jennifer A. Doudna 教授說明，基因編輯可分為體細胞編輯（Somatic cell editing）和生殖細胞編輯（Germline cell editing）兩個層級，造成的影響和道德倫理爭議有很大的區別。體細胞編輯的基因修飾多用於特定部位的疾病治療，影響只限於細胞或是局部組織，並不會造成系統性的變化，也不會遺傳到下一代，所面臨的醫學倫理爭議較小。然而，生殖細胞編輯則是在受精卵仍在胚胎初期時就進行基因編輯，將整個胚胎的基因序列做整體性的改變，能夠將確定致病的基因突變序列直接矯正成為正常的基因序列，有效地根除單基因遺傳疾病或遺傳性的致病突變（例如 BRCA 基因變異遺傳），產生永久性的影響，進而衍生出基因訂製寶寶的議題。
▲ 生殖細胞編輯進而衍生出基因訂製寶寶的議題。
Jennifer A. Doudna 教授解釋，透過基因編輯來訂製寶寶以當今的科技還是沒有辦法做到，因為有許多生理特徵是同時受到多個基因的作用影響，而且特徵與基因序列之間的關聯性並未清楚地被建立，但卻能夠透過先進的胚胎基因篩檢 / 診斷和基因編輯技術，幫助許多深受基因遺傳疾病所苦的民眾和家族。創新科技的進展快速，對於人類社會與地球環境的發展確實有可能成為雙面刃，她期許未來 CRISPR 基因編輯的應用能夠朝向受控制且良善的應用發展，造福廣大的民眾。
註 1：發現 CRISPR / Cas9 機轉與應用的 3 位科學家:法國的伊曼紐‧夏彭提耶（Emmanuelle Charpentier）、美國的珍妮佛‧道納（Jennifer A. Doudna）與華裔美籍的張鋒（Feng Zhang），共同獲得 2016 年唐獎生技醫藥獎的殊榮肯定。
註 2：CRISPR / Cas 系統可概略分成三大類：Type I、II、III。其中 Type I、III 只需要 crRNA 就可以找到病毒 DNA；而 Type II 則需要 crRNA 和 tracrRNA 合作才能找到。不過 Type I、III 系統，如果要切斷目標 DNA 的雙股序列，就需要 8 種 Cas 蛋白參與，機轉相當複雜；而 Type II 系統僅需要一種 Cas 蛋白（Cas9）參與，且在 crRNA 和 tracrRNA 的雙重引導之下，能夠精準地鎖定目標 DNA 序列，因此 CRISPR / Cas9 成為基因編輯最主流的工具。
A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.
Bypassing Negative Epistasis on Yield in Tomato Imposed by a Domestication Gene.
Guide-bound structures of an RNA-targeting A-cleaving CRISPR-Cas13a enzyme.
Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.
（本文由 GeneOnline 授權轉載）