การเลี้ยงเชื้อเห็ดบริสุทธิ์บนอาหารวุ้น PDA
จะต้องทำในสภาพปลอดเชื้อ และ ห้องปลอดเชื้อทั้งนี้เพื่อป้องกันการปนเปื้อนจากเชื้อภายนอกที่จะส่งผลทำให้เชื้อเห็ดที่ผลิตได้ ไม่บริสุทธิ์ เสียหาย ปนเปื้อน เส้นใยไม่เดินในอาหารวุ้น ขั้นตอนนี้จำต้องอาศัย เทคนิคความรู้ความชำนาญส่วนบุคคลประกอบด้วย จึงจะได้เชื้อเห็ดบริสุทธิ์ปลอดการปนเปื้อน
อุปกรณ์ที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเชื้อเห็ด :
1. สปอร์หรือดอกเห็ดที่สมบูรณ์
2. มีดผ่าตัดขนาดเล็ก
3. ตะเกียงแอลกอฮอล์แบบมีฝาปิด
4. เข็มเขี่ยเชื้อขนาดยาว 18-20 เซนติเมตร ส่วนปลายมีด้ามจับ ส่วนปลายด้านตรงข้ามเป็นลวดงอหักเป็นมุมฉากจากปลาย 5 มิลลิเมตร
5. ตู้เพาะเลี้ยงเชื้อ หรือห้องที่สะอาด สามารถปิดกั้นลมพัดถ่ายเทเข้าออกระหว่างที่ทำการเพาะเลี้ยงเชื้อ
6. อาหารวุ้น PDA
7. จานแก้วมีฝาครอบ
8. หม้อนึ่งความดันไอน้ำ
9. กระดาษซับ ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
10. สาร ละลายเมอร์คิวริกคลอไรด์ (Mercurichoride) 0.1 %
*** ก่อนทำการเขี่ยเชื้อเห็ด ควรใช้แอลกอฮอล์ 70% ฉีดพ่นมือทั้งสองข้างให้ทั่ว และไม่ควรสวมใส่เครื่องประดับที่มือ เพราะเป็นแหล่งสะสมเชื้อโรคและการฆ่าเชื้ออาจเข้าไปได้ไม่ทั่วถึง
วิธีการแยกเนื้อเยื่อจากดอกเห็ด :
การฆ่าเชื้อ ให้ใช้สำลีที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วชุบแอลกอฮอล์70 % เพื่อฆ่าเชื้อบริเวณผิวนอกของเห็ด แล้วใช้กระดาษซับที่ปราศจากเชื้อ(ผ่านการฆ่าเชื้อ)ซับให้แห้ง หรือ แช่ดอกเห็ดในสารละลายเมอร์คิวริกคลอไรด์ 0.1 % เป็นเวลานาน 5% จากนั้นล้างด้วยน้ำสะอาดแล้วเช็ดดอกเห็ดให้แห้ง แล้วนำไปใส่ในภาชนะสะอาดที่เตรียมไว้ใช้
การตัดเนื้อเยื้อเห็ด :
ให้ฉีกเห็ดออกแล้วใช้มีดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วมาตัดตรงบริเวณรอยต่อของหมวกดอกและก้านเห็ด หรือ ตลบริเวณ ครีบหมวกออกมา 1 ชิ้น วางบจานแก้วแล้วเฉือนเป็นชิ้นบางๆ ขนาดประมาณ 0.5 1 เซนติเมตร การตัดเนื้อเยื่อให้เป็นชื้นเล็ก ๆ จะช่วยลดการปนเปื้อนจากเชื้อราได้ ปละจะทำให้ได้เชื้อเห็ดที่บริสุทธิ์มากยิ่งขึ้น ที่สำคัญคือ เนื้อเยื่อที่มีขนาดเล็กจะมีเปอร์เซ็นต์การตายยากขึ้น
การติดเนื้อเยื่อเห็ดลงบนอาหารวุ้น :
ให้ใช้เข็มเขี่ยลนเปลวไฟ(ช่วงที่มีสีแดง)จากตะเกียง แอลกอฮอล์ ลนจนปลายเข็มร้อนแดง เป็นการฆ่าเชื้อที่เข็มเขี่ย จากนั้นพักเข็มให้คลายความร้อนสักพักหนึ่ง เพื่อไม่ให้ความร้อนจากปลายเข็มไปฆ่าเนื้อเยื่อเห็ด จากนั้นจึงใช้เข็มเขี่ยเนื้อเยื่อเห็ดไปใส่ไว้ตรงส่วนกลางของอาหารวุ้น ที่เตรียมไว้ในขวด หรือในหลอดแก้ว โดยก่อนเปิดปากขวดควรลนฆ่าเชื้อบริเวณปาขวดก่อนเปิดและควรลนปากขวดอีกครั้งก่อนปิดปากขวดแล้วอุดด้วยจุกสำลี หุ้มทับด้วยกระดาษและรัดยาง ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วอีกชั้นหนึ่งเป็นอันเสร็จขั้นตอนของการเขี่ยเนื้อเยื้อเห็ด ลงบนอาหารวุ้น
** หลังจากวางเนื้อเยื่อเห็ดบนอาหารวุ้นได้ 7-10 วันเส้นใยจะเจริญเติบโตบนอาหารวุ้น และ สามารำนำไปขยายพันธุ์ได้ต่อไป